0

Wykrywanie biotynylowanych białek za pomocą streptawidyny

Wykrywanie biotynylowanych białek w komórkach

1 Umieść komórki na szkiełkach nakrywkowych i pozwól im się przyczepić przez co najmniej jedną noc. Dołączyć kontrolę negatywną, która nie zawiera biotynylowanego białka (białek) będącego przedmiotem zainteresowania. Przeprowadź biotynylację komórek albo po wysianiu albo przed posadzeniem szkiełek nakrywkowych.

  1. Przemyć komórki lub tkankę w buforze (takim jak sól fizjologiczna buforowana fosforanem).
  2. Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu w 1x PBS (137 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, 20 mM KH2PO4). (Przygotuj roztwór paraformaldehydu pod wyciągiem, używając najpierw 9 części wody, a następnie dodaj 1 część 10x PBS, aby uzyskać roztwór o ostatecznym stężeniu 1x PBS. Należy również lekko wymieszać i podgrzać roztwór, a następnie dodać kilka krople 0,2 M NaOH, aby ułatwić rozpuszczenie. Nie wyjmować z wyciągu, dopóki roztwór nie ostygnie.)
  3. Przemyć kilka razy PBS.
  4. Zablokuj 5% BSA w PBS.
  5. Wyznaczyć za pomocą streptawidyny skoniugowanej z barwnikiem w ciemności przez 30 minut (najpierw spróbować rozcieńczenia 1/1000, jeśli daje wysokie tło, spróbuj rozcieńczenia niższego).
  6. Płukać 3-4 razy po 10-15 minut za pomocą PBS.
  7. Dodaj mowial i zamontuj szkiełko nakrywkowe do góry nogami na slajdzie. Zakryj brzegi szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i pozostaw lakier do wyschnięcia. Oglądaj pod mikroskopem fluorescencyjnym po odpowiednim przeszkoleniu od innych osób.

Wykryte biotynylowane białka działające na żelu

Podobnie jak powyżej, należy dołączyć kontrolę negatywną, która nie zawiera biotynylowanego białka (białek) będącego przedmiotem zainteresowania.

  1. Przygotuj żel białkowy i przenieś go na membranę do blottingu, jak opisano.
  2. Blokować blot 5% BSA w PBS (137 m M NaCI, 27 mM KCI, 80 mM Na2HPO4, 20 mM KH2PO4) przez 1 godzinę.
  3. Dodać skoniugowaną streptawidynę do peroksydazy chrzanowej w PBS-Tween (PBS + 0,05% Tween 20) + 1% BSA przy stężeniu streptawidyny między 1 / 5000-1 / 20 000.
  4. Płukać kilka razy w PBS-Tween po kilka minut za każdym razem i wykryć za pomocą ECL zgodnie z opisem.

Pawel

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *